От видимой слизи до скрытого кода Полоскание горла соленой водой с добавлением мыла и спирта удаляет слизистые комки — вашу ДНК, смешанную с бактериями полости рта, — но даже мощные микроскопы показывают только волокна, а не код. Генетическая последовательность, которая может раскрыть происхождение, отцовство, риски заболеваний и подсказки о раке, оставалась нечитаемой в течение десятилетий. Секрет оставался закрытым, пока неожиданный способ не открыл его.
Хаотичный Разум находит Биотехнологии В 1960-х годах Кэри Маллис, биохимик из Беркли, прогуливал занятия, принимал большие дозы ЛСД и даже отправил Nature письмо, в котором изложил “историю Вселенной”. Побывав в лабораториях, прозе и пекарне, он познакомился с Томом Уайтом и присоединился к молодой биотехнологической компании Cetus, которую ценили за его умение синтезировать молекулы, в том числе галлюциногены. Примерно в то же время работа над бактериофагами выявила бактериальную защиту: эндонуклеазы рестрикции, молекулярные ножницы, которые разрезают ДНК на определенные последовательности.
Рестрикционные ферменты и первые тесты ДНК Бактерии сканируют вторгшуюся вирусную ДНК и разделяют ее на безвредные фрагменты с помощью эндонуклеаз рестрикции, которые ученые научились использовать в качестве инструментов. Cetus стремился превратить такие инструменты в быстрые клинические анализы, которые считывают ДНК, а не клетки, и нацелены на такие заболевания, как серповидноклеточная анемия. Ген бета-глобина, расположенный в конце 11-й хромосомы, может содержать однобуквенное изменение — T заменяет G, — которое, будучи унаследованным от обоих родителей, деформирует красные кровяные тельца. Найти одну неправильную букву среди более чем шести миллиардов нуклеотидов - все равно что прочитать номерной знак с Луны.
Трудный путь поиска единственной мутации Рестрикционные ферменты разделяют геномы на фрагменты, а гель–электрофорез сортирует их по длине, чтобы можно было выделить фрагмент из 2000 пар оснований, содержащий мишень. Денатурация разделяет цепочки, а комплементарное спаривание оснований позволяет синтетическим ДНК-зондам связывать только соответствующую последовательность. Радиоактивные метки обнаруживают сигнал после того, как несвязанные зонды вымываются. Поскольку зонды связываются везде, где встречается последовательность, сначала необходимо выделить нужный фрагмент; Саузерн-блоттинг работает, но занимает дни или недели и содержит опасную радиоактивность. Даже семичасовой анализ с использованием одной пробирки, разработанный Cetus, давал сигналы настолько слабые, что их было трудно прочитать.
Автоматизация освобождает разум для размножения ДНК Работа Маллиса заключалась в проведении коротких радиоактивных исследований — монотонная работа, которая портила ему настроение, — пока новый синтезатор за один день не сделал то, на что у него ушли месяцы. У него было время подумать, и он представил себе, как окружает известную последовательность двумя праймерами, по одному на каждой нити, и позволяет ДНК-полимеразе распространяться от их 3'-концов. Денатурируйте, отжигайте и снова расширяйте, чтобы многократно удваивать целевой показатель — 2, 4, 8, 16 — до тех пор, пока не накопятся миллиарды. Он назвал эту идею полимеразной цепной реакцией, записывая ее на чеках с бензоколонки, а позже задавался вопросом, не ЛСД ли настроил его мозг на это.
От увольнения до демонстрации Руководство и коллеги, привыкшие к его необузданным выходкам, отнеслись к ним скептически, а его первые эксперименты с человеческой и бактериальной ДНК не поддавались контролю и провалились. После драк и подорванного доверия ему дали год, но сказали поработать с Томом Уайтом, Норманом Арнхеймом и Генри Эрлихом, чтобы воплотить это в жизнь. Месяцы проб и ошибок завершились весной 1985 года, когда была разработана эффективная ПЦР и проведен отличный, примерно десятичасовой, тест на серповидноклеточный анализ. Концепция была доказана, но оставалось одно практическое препятствие.
Термостабильные ферменты из Кипящих Источников Цикл ПЦР требует нагревания примерно до 95°C для разделения цепочек и охлаждения для связывания праймеров, но полимераза E. coli погибает при нагревании, что требует ручного добавления в каждом цикле. Двумя десятилетиями ранее Томас Брок и Хадсон Фриз обнаружили Thermus aquaticus, обитающего в скальдинг-Спрингс в Йеллоустоне, и сохранили его в коллекциях культур. Ферменты таких микробов адаптированы к температурам, близким к температуре кипения. Группа Муллиса выделила полимеразу T. aquaticus и провела ее тестирование.
Чистый, быстрый, экспоненциальный анализ: Taq запускает ПЦР Новый фермент выдержал многократное нагревание и даже улучшил результаты: при более высоких температурах праймеры не прилипали к частичным совпадениям, что уменьшало шум. Примерно через 30 циклов в течение нескольких часов накапливался миллиард точных копий мишени. Любой фрагмент ДНК — человека, растения или бактерии — мог быть амплифицирован по желанию. ПЦР превратилась в золотую жилу, и гонка за патентами вынудила Cetus действовать быстрее.
Заслуги, патенты и рождение термоциклеров Коллеги настаивали на скорейшей публикации, но Маллис колебался; первая статья появилась без него, и позже он обвинил других в краже его идеи. Общественное признание последовало за выступлением на симпозиуме в 1986 году, однако вскоре он покинул Cetus, так и не простив команду, которая ему помогла. Компания продолжила разработку автоматизированных ПЦР-машин, которые выполняли весь процесс изменения температуры. Термоциклеры появились в лабораториях по всему миру.
Инструмент, который освобождал невинных и находил родственников ПЦР способствовала клонированию, производству вакцин, анализу на онкомаркеры и тестированию на ВИЧ, а также выявлению раковых клеток, которые не были обнаружены другими тестами. Для анализа стало достаточно крошечных образцов ДНК; сотни невинных заключенных были освобождены, а тысячи преступников опознаны. Семьи, разделенные войной, нашли друг друга. На фоне этого бума всплыли даже ложные заявления — например, о ДНК насекомых в янтаре.
Гениальность, дурная слава и опасные опровержения Маллис прославлял наркотики как источник своего вдохновения, получил Японскую премию и Нобелевскую премию в 1993 году и часто ставил это себе в заслугу. Он рассказывал истории о светящихся енотах и похищениях инопланетянами, написал книгу "Танцующие обнаженные в поле зрения", давал показания на процессе О. Джея Симпсона и продавал безделушки, сделанные из амплифицированных ДНК знаменитостей. Он отрицал глобальное потепление, озоновую дыру и то, что ВИЧ вызывает СПИД. Президент Южной Африки поддержал взгляды ВИЧ‑диссидентов и пригласил нобелевского лауреата поддержать их, что привело к отказу в лечении и унесло жизни более 330 000 человек. Муллис умер в августе 2019 года от осложнений пневмонии, но ПЦР не помогла.
Автоматизация Превратила Тяжелую Работу в Открытие Год спустя, во время пандемии COVID‑19, ПЦР доказала свою неоценимую эффективность, проведя тесты, которые помогли защитить миллиарды людей. В статье показано, как автоматизация утомительных задач может заставить людей мыслить шире, поскольку синтезатор зондов позволил компании Mullis переосмыслить анализ ДНК. Опасения, что роботы займут рабочие места, сосуществуют с реальностью, согласно которой автоматизация может стимулировать творчество и прорывы. Превращая монотонность в простор для воображения, мы можем открыть инструменты, которые изменят мир.