Начало идентификации микроорганизмов: Клеточная структура и микроскопия Клиническое исследование начинается с получения образца на вашем стенде и выращивания культуры на питательной среде. Идентификация начинается с изучения структуры бактериальных клеток и выбора подходящих методов микроскопии. Эти первые наблюдения служат руководством для всех последующих тестов и практических задач.
Почему окрашивание преобразует Неинформативные нативные мазки Неокрашенные (нативные) препараты имеют нечеткие очертания и мало что говорят о клетках или их компонентах. Простые окрашивания одним красителем, таким как метиленовый синий или фуксин, быстро создают контраст. Становятся видны более четкие контуры, формы и расположение, что позволяет осмысленно интерпретировать их.
Размер Имеет Значение, Но Приближения Часто Бывает Достаточно Размеры бактерий измеряются в микрометрах с помощью окулярного микрометра. При рутинной работе точные измерения проводятся редко, поскольку они отнимают много времени. Опытные наблюдатели описывают размер сравнительно — маленький или большой — по сравнению с внутренним стандартом.
Распознавание основных форм бактерий Клинически значимые бактерии обычно представлены в виде трех основных форм: кокков (сферической формы), палочек (удлиненной формы) и спиралей. Форма относится к одной клетке, хотя многие клетки находятся в одном поле зрения. Могут наблюдаться необычные изгибы, но большинство диагностических решений основывается на этих основных формах.
Расшифровка диплококков: Кофейные зерна и ланцеты Диплококки представляют собой парные сферические клетки с характерными прилегающими поверхностями. Neisseria gonorrhoeae выглядят как пары, похожие на кофейные зерна, с уплощенными сторонами, обращенными друг к другу. Streptococcus pneumoniae образует парные клетки с уплощенными контактными поверхностями и более ланцетным или треугольным профилем.
Цепочки в сравнении с названиями: Стрептококковые структуры Кокки, расположенные цепочками, описываются как стрептококковые микроорганизмы. Этот термин указывает на характер расположения, не обязательно относящийся к роду Streptococcus. Точное описание расположения позволяет избежать путаницы между морфологией и таксономией.
Виноградные гроздья и значение стафилококков Скопления кокков неправильной формы напоминают виноградные гроздья и называются стафилококковыми образованиями. Этим же словом также называется род, поэтому в контексте морфология отличается от таксономии. Существуют и другие формы кокков, которые редко влияют на клинические решения.
Палочки в парах, цепочки и похожие на бамбук бациллы Парные палочки называются диплобациллами и могут быть обнаружены у клебсиелл, которые часто вызывают пневмонию и внутрибольничные инфекции. Цепочки палочек называются стрептобациллами. Большие палочки рода Bacillus с квадратными концами часто выстраиваются в линию, напоминающую бамбук, что обычно ассоциируется с возбудителем сибирской язвы.
От запятых до спиралей: Вибрионы, спириллы, спирохеты Холерный вибрион представляет собой изогнутые палочки, которые могут выглядеть как запятые, часто с полярным жгутиком. Спириллы имеют широкие, правильные витки и симметричную спираль. Спирохеты тоньше, длиннее, имеют много неправильных витков, плохо окрашиваются обычными методами и лучше всего проявляются с помощью специализированных методик.
Нитевидные бактерии и возможная польза при вирусных заболеваниях Сегментированные и несегментированные нитевидные формы встречаются в кишечной микрофлоре и не вызывают заболеваний у человека. Новые исследования показывают, что они могут облегчать течение некоторых вирусных инфекций, таких как ротавирус. Их точная роль остается в стадии изучения и может изменить направление преподавания в будущем.
Простота прокариот: размер, геном и деление Бактериальные клетки примерно в 10-100 раз меньше, чем клетки эукариот, и имеют меньшую структуру. У них отсутствует мембраносвязанное ядро; их единственная круглая гаплоидная хромосома находится в цитоплазме. При бинарном делении образуются две генетически идентичные дочерние клетки.
Отсутствие митохондрий, Меньшие размеры рибосом, Минимальный каркас. Бактерии не содержат митохондрий; их небольшой размер не оставляет места для таких органелл. Настоящий цитоскелет отсутствует. Их рибосомы имеют размер 70S, что меньше, чем 80S рибосом эукариотических клеток.
Бактериальную клетку характеризуют пять основных элементов Каждая типичная бактериальная клетка состоит из клеточной стенки, плазматической мембраны, цитоплазмы, хромосом (нуклеоидов) и рибосом. Стенка защищает, поддерживает жесткость и фиксирует форму клетки. Мембрана обеспечивает избирательный обмен, а цитоплазма содержит растворенные компоненты, необходимые для жизнедеятельности.
Дополнительный арсенал: Подвижность, Адгезия, Капсулы, Хранение, Плазмиды Жгутики обеспечивают подвижность и различаются по количеству и расположению. Пили (фимбрии) способствуют адгезии к тканям и поверхностям, способствуя колонизации. Капсулы защищают от иммунитета хозяина и физических факторов; инклюзионные тельца накапливают питательные вещества; плазмиды несут дополнительные гены, в том числе устойчивость к антибиотикам, и легко распространяются между бактериями.
Капсулы защищают, сохраняют и усиливают течение болезни Капсулы обволакивают стенки, блокируя антитела и ферменты и помогая клеткам противостоять агрессивной среде. Толстые слои образуют макрокапсулы; тонкие слои образуют микрокапсулы с аналогичным, но более слабым действием. Капсулы могут задерживать воду и вещества, когда внутриклеточное пространство ограничено, что способствует развитию более тяжелых инфекций.
Толщина пептидогликанов Разделяет грамположительные и грамотрицательные клетки Грамположительные клетки содержат много слоев пептидогликанов с тейхоевой кислотой, образуя толстую, прочную оболочку. Грамотрицательные клетки имеют тонкий слой пептидогликанов и внешнюю мембрану, мозаично содержащую липополисахарид (эндотоксин). Эти структурные различия лежат в основе различных реакций на физический стресс, химические вещества и окрашивание.
Окрашивание по Граму Служит руководством для ранней эмпирической терапии Антибиотики воздействуют на специфические бактерии‑мишени, которые различаются у грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов. Полная идентификация вида может занять около трех дней, но пациенты нуждаются в лечении немедленно. Результат, полученный в тот же день, оправдывает первоначальную целенаправленную эмпирическую терапию и служит руководством для дальнейшего тестирования.
Мезосомы компенсируют недостающие митохондрии Выработка энергии связана с мезосомами — образованиями плазматической мембраны, которые расширяют реактивную поверхность. Они слишком малы для световой микроскопии и различаются у бактерий. Несмотря на свой скромный внешний вид, они поддерживают важные энергетические процессы.
Эндоспоры: Состояние покоя в неблагоприятных условиях Споры бактерий - это внутренние структуры для выживания, а не репродуктивные единицы, как у грибов. Когда условия ухудшаются, нуклеоид становится разделенным путем инвагинации мембраны, которая затем уплотняется и покрывается корковым слоем и прочной белковой оболочкой. Материнская клетка погибает, в то время как спора сохраняется в метаболически неактивном состоянии.
Определение размера, формы и положения спор Признаки спор помогают распознать их: размер относительно стержня (меньше или больше), форма (сферическая или овальная) и расположение (центральное, верхушечное, субтерминальное). Крупные споры могут деформировать клетку. Их низкая проницаемость обеспечивает устойчивость к химикатам и другим агрессивным факторам.
Споры Требуют более Строгой Стерилизации Спорообразователи могут сохраняться в течение длительного времени и вновь появляться, когда условия улучшаются, вызывая заболевание без очевидного источника. Стандартная стерилизация может не справиться со спорами, поскольку они устойчивы к воздействию тепла, радиации и многих дезинфицирующих средств. При использовании спорообразователей для обеззараживания требуются более агрессивные методы.
Узоры жгутиков соответствуют идентичности Жгутики подразделяются по количеству и расположению на монотрихные (однополярные), лофотрихные (пучок на одном полюсе), амфитрихные (на обоих полюсах) и перитрихные (по всей поверхности). Эти особенности помогают дифференцировать таксоны. Подвижность также определяет то, как бактерии перемещаются в жидкой среде.
Дополнительные структуры ускоряют идентификацию Необязательные признаки, хотя и отсутствуют у многих видов, стабильны у тех, которые ими обладают. Обнаружение капсул, спор или характерных жгутиков может сразу сузить возможности. В некоторых случаях для идентификации достаточно только отличительной морфологии.
Основы работы в ярком поле: Простая и универсальная визуализация Микроскопы с ярким полем зрения используют видимый свет от зеркала или встроенной лампы, который фокусируется конденсором через образец на объектив и окулярные линзы. Поле зрения выглядит ярким, а объекты, поглощающие свет, - более темными. Они просты в эксплуатации, доступны по цене и подходят для окрашенных и натуральных материалов при многократном увеличении.
Фазовый контраст Выявляет Живые Клетки Без Пятен Фазовое кольцо и пластина разделяют и рекомбинируют световые пути, превращая фазовые сдвиги в различия в интенсивности. Объекты с разной оптической плотностью приобретают светящиеся ореолы и резкий контраст. Это позволяет наблюдать живые, неокрашенные клетки, в том числе подвижность и деление клеток.
Темное поле: Звезды на черном небе Наклонное освещение рассеивает свет, так что он попадает в объектив только в том случае, если он отражается от образца. Фон остается черным, в то время как бактерии выделяются яркими силуэтами. Это позволяет наблюдать подвижность и очень тонкие спиральные клетки, которые плохо видны при ярком освещении.
Флуоресценция Обеспечивает быстрое и специфичное обнаружение Флуоресцентные красители и меченые антитела поглощают ультрафиолетовый свет и излучают видимые сигналы, окрашивая клетки или определенные компоненты в яркие цвета. Этот метод позволяет быстро и надежно диагностировать опасные или слишком медленные процессы культивирования, например, при чуме или сибирской язве. Немногие бактерии флуоресцируют естественным образом, поэтому окрашивание является стандартным.
Электронная микроскопия для получения ультраструктурных деталей Электронные лучи заменяют фотоны, обеспечивая гораздо большую разрешающую способность и увеличение. Изображения позволяют увидеть ультраструктуру клеток вплоть до мельчайших субклеточных элементов. Подготовка к исследованию сложна, требует много времени и опасна, поэтому электронная микроскопия служит скорее для исследования, чем для рутинной диагностики.
Просмотр капсул путем окрашивания фона Капсулы не содержат обычных красителей, поэтому отрицательное окрашивание окрашивает фон и цитоплазму, оставляя при этом прозрачный ореол. При использовании чернил или модифицированных методов после окрашивания фуксином капсулы становятся видимыми. При использовании этого метода у Klebsiella pneumoniae часто появляется выпуклая капсула.
Превращение невидимых нитей в видимые Жгутики требуют специальных окрашиваний, таких как лейфсоновские, чтобы они были видны в виде тонких нитей вокруг клетки. Пропитка серебром (например, Морозова) осаждает металл на спирохетах и жгутиках, образуя темно-коричневые нити на желтоватом фоне. Эти методы выявляют структуры, невидимые для обычных окрашиваний.
Стойкие к воздействию кислот пятна Выделяют микобактерии и споры При окрашивании по методу Циля–Нильсена используются нагретые сильные реагенты, которые окрашивают обычные клетки в синий цвет, в то время как кислотоустойчивые микобактерии остаются рубиново‑красными. Это основной метод при подозрении на туберкулез или проказу. Связанная с этим модификация окрашивает споры в красный цвет, в то время как вегетативные клетки кажутся синими, что упрощает обнаружение спор в клиническом материале.
Выполнение и интерпретация определения по Граму Последовательность действий следующая: кристаллический фиолетовый (горечавка), йод (Люголь), обесцвечивание спиртом, затем противокрашивание фуксином. Чрезмерное воздействие спирта может привести к разрушению мазка; необходимо немедленно промыть. Фиолетовые клетки являются грамположительными, красные ‑ грамотрицательными ‑ расшифровка, которую следует записать вместе с набросками для дальнейшего использования.